La spectrosco​pie optique en passe de revolutionner la mesure de la biocontamination


Sans titreLe développement de la microbiologie rapide a le vent en poupe.

Il devient de plus en plus insupportable d’attendre au rythme microbiologique le délai pour identifier un germe ou de pouvoir dénombrer les quantités bactériennes… souvent réalisées 24 à 48 heures après, lorsqu’il ne s’agit pas d’attendre 7 jours pour les flores fongiques. Parmi ces méthodes on peut citer des méthodes de biologie moléculaire telle que la PCR en temps réelle, biochimiques telle que l’ATPmétrie et maintenant physiques telle que  la Spectroscopie Optique.

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C’est après les événements de septembre 2011 aux Etats-Unis que cette technologie a été développée, alors que la crainte d’une attaque par arme biologique à base de spores de Bacillus anthracis modifiées était maximale. C’est l’armée américaine qui developpa cette technologie démarquée parmi d’autres prototypes. Le besoin était de pouvoir évaluer le risque de présence d’organismes viables mais non cultivables (VBNC). Ces VBNC sont tous ces micro-organismes capables de se mettre en état de dormance:

Tableau A: Micro-organismes possédant un état de dormance:

Aeromonas salmonicida Agrobacterium tumefaciens Alcaligenes eutrophus
Aquaspirillum sp. Burkholderia cepacia Burkholderia psudomallei
Camphylobacter coli Camphylobacter jejuni Camphylobacter lari
Cytophaga allerginae Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis Enterococcus hirae Enterococcus faecium
Escherichia coli Francisella tularensis Helicobacter pylori
Klebsiella aerogenes Klebsiella pneumoniae Klebsiella planticola
Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis Legionella pneumophilia
Listeria monocytogenes Micrococcus flavus Micrococcus luteus
Micrococcus varians Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium smegmatis
Pasteurella piscida Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida Pseudomonas syringae Ralstonia solanacearum
Rhizobium leguminosarum Rhizobium meliloti Rhodococcus rhodochrous
Salmonella enteridis Salmonella typhi Salmonella typhirium
Serratia marcescens Shigella dysenteriae Sinorhizorium meliloti
Streptococcus faecalis Tenacibaculum sp. Vibrio anguillarum
Vibrio campbellii Vibrio cholerae Vibrio fischeri
Vibrio harveyi Vibrio mimicus Vibrio natriegens
Vibrio parahaemolyticus Vibrio proteolytica Vibrio shiloi
Vibrio vulnificus types 1 et 2 Xanthomonas campestris

La spectroscopie optique était déjà utilisée, dans les années 90, pour la détection des allergènes dans l’air. Elle a été adaptée et depuis 2005 sa sensibilité et  sa spécificité ont été améliorées afin de répondre aux besoins de l’industrie pharmaceutique et des environnements ultrapropres.

« Stress thermique, chimique, absence d’eau, passage d’un milieu hostile et carencé à un milieu nutritif riche, facteurs de croissance manquants, teneur en CO2 ou O2… Un rapport publié en 1997 par Heidelberg et al. indique que beaucoup de bactéries restent viables après avoir été aéroportées, mais perdent leur faculté de former des colonies. »

Il est dors et déjà reconnu que les aérobiocollecteurs possèdent une efficacité biologique et une efficacité physique d’impaction très variables d’un modèle à un autre selon la vitesse d’impaction, la conception des cribles ou l’utilisation de milieu complémentés.

L’ensemble des éléments cités plus haut rappelle simplement à la vigilance et à l’ouverture sur de nouvelles technologies plus sensibles, ceci même si les techniques classiques ont été éprouvées et ont fait leurs preuves depuis des années.

La position de la FDA est claire sur ce sujet : la division spécialisée dans l’évaluation des RMM voit d’un oeil favorable l’adoption de nouvelles technologies plus sensibles et résolutives permettant une meilleure connaissance et donc un meilleur contrôle des process.

Ce que promet déjà cette technique est « la détection simultanée de la taille et de la nature des contaminants ».

Le système Biovigilant:

« L’IMD-A de Biovigilant a été validé dans le laboratoire G-lab du groupe Yamatake à Fujisawa au Japon, niveau de sécurité P2. »

Ce nouveau système « utilise une propriété naturelle de certains métabolites présents dans les micro-organismes : l’émission d’un rayonnement de fluorescence en réponse à l’excitation induite par de la lumière laser. Le NADH (nicotinamide adénine dinucléotide oxydé) et la riboflavine sont deux coenzymes utilisés pour les formes végétatives et l’acide dipicolinique (constituant de la paroi) pour les formes sporulées. »

Deux informations seront données, la taille de la particule obtenue en diffraction de la lumière laser et, au même instant et en fonction de la détection ou non de la fluorescence, s’il s’agit d’une particule inerte ou biologique (figure ci-dessous, source: http://www.processpropre.fr/Archives-article/Fiche/941#)

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« La fluorescence est captée par un réflecteur semi-ellipsoïdal dont la fonction est de recueillir, d’amplifier considérablement et de focaliser le signal sur le tube photomultiplicateur.

La chambre optique a été mathématiquement modélisée (ci dessous), la forme particulière du réflecteur va collecter la fluorescence émise par le micro-organisme selon un angle de 270 degrés, amplifiant par un facteur 100 à 1 000 le signal par rapport à des systèmes optiques classiques, qui détectent la fluorescence sur quelques degrés, voire moins. Ce dispositif rend possible la visualisation en temps réel sans marquage préalable.

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Le coeur du système est conçu avec un niveau de bruit remarquablement bas, la fluorescence induite par une bactérie monodispersée étant très faible. De nombreux seuils, en fluorescence, en diffraction laser et sur des ratios de ces deux grandeurs ont été définis puis validés pour garantir la spécificité du système aux micro-organismes, bactéries, levures et moisissures.

Biovigilant a également développé une particule submicronique » (taille inférieure au micron)  « présentant une réponse en fluorescence comparable à celle d’une bactérie monodispersée. Cette dernière est utilisée pour vérifier le seuil de détection.

Le système va plutôt détecter les organismes viables, même si aucune garantie sur ce point n’est revendiquée par le concepteur. Dans le cas de destruction par des agents chimiques oxydants, les métabolites sont dénaturés et ne fluorescent plus. Dans le cas de destruction par la chaleur sèche ou chaleur humide le signal passe en dessous du seuil de détection après une durée très variable d’un micro-organisme à un autre, de quelques heures à quelques jours. »

Il est possible de trouver les informations de validation de la technique (matériel, souches, conditions environnementales, modélisations mathématiques) sur l’article source.

Conclusion

« L’IMD-A est un puissant outil analytique dont l’utilisation est particulièrement pertinente lors de media fill tests, d’analyses de risque ou encore lors d’investigations sur des sources potentielles de microcontaminations.

Le système apporte une solution en temps réel et indépendante des contraintes complexes de biocollection et de croissances rencontrées sur les méthodes classiques.

Cette technologie permet également un véritable contrôle en continu du niveau de contamination microbiologique et de fait s’intègre parfaitement dans des démarches de Quality by Design. »

Cependant, le système ne permet pas la récupération des germes pour une analyse ultérieure, ce qui dans de nombreux cas en hygiène hospitalière pose un véritable soucis dans les enquêtes épidémiologiques lors de cas d’infections. Aucune comparaison de souches par le biais d’une technique de biologie moléculaire n’est possible.

Source:

http://www.processpropre.fr/Archives-article/Fiche/941

autres sources:

http://www.biovigilant.com/PDFs/Articolo%20Bolotin.pdf  (en italien)

http://www.promedianet.it/pdf_articoli/lab_05_36-37.pdf (en italien)

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Publié le 22 décembre 2012, dans Actualités Scientifiques, Laboratoire, Surveillance / Veille. Bookmarquez ce permalien. Poster un commentaire.

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